產(chǎn)品名稱：耐萬古霉素腸球菌/雙重探針法熒光定量PCR試劑盒

英文名稱：Vancomycin-Resistant Enterococcus(VRE)vanA/vanB

產(chǎn)品貨號：LZ-P4177

分類：PCR檢測試劑盒

儲存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。

運(yùn)輸：低溫、避光，快遞免費(fèi)送貨上門。

PCR檢測試劑盒有效期一般為1年，這是指在適當(dāng)?shù)膬Υ鏈囟认?。耐萬古霉素腸球菌核酸擴(kuò)增部分的試劑一般要貯存于-20℃下，產(chǎn)物檢測部分試劑則貯存于2-8℃。盡量避免反復(fù)凍融。天津

【結(jié)果分析條件設(shè)定】

u 基線（Baseline）設(shè)定：應(yīng)選擇該次實驗指數(shù)擴(kuò)增前所有樣本熒光信號比較穩(wěn)定的一段區(qū)域（所有樣本熒光信號無較大波動），起始點(diǎn)（Start）應(yīng)避開熒光采集起始階段的信號波動，終止點(diǎn)（End）應(yīng)比早出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增的樣本Ct值減少1~3個循環(huán)，建議基線設(shè)為6~15。

u 閾值(Threshold)設(shè)定：將閾值線設(shè)定在剛好超過正常陰性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線的高點(diǎn)。

【質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)】

1.  陰性質(zhì)控品的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性，無指數(shù)擴(kuò)增期，Ct=40或無Ct；

2.   陽性質(zhì)控品的檢測結(jié)果應(yīng)為陽性，有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期，Ct值應(yīng)小于等于35；

3.   以上要求需在一次實驗中同時滿足，否則該次實驗視為無效。

【結(jié)果判斷】

1熒光定量PCR試劑盒.陽性：有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期，且Ct＜38；

2.可疑：有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期，且38≤Ct<40，此時樣本為可疑樣本；對于可疑樣本建議復(fù)核一次，若復(fù)核結(jié)果Ct<40且有指數(shù)擴(kuò)增期，則判定為陽性，否則判定為陰性；

3.   陰性：無指數(shù)擴(kuò)增期，Ct=40或無Ct值均判定為陰性樣本。

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

　　?、僖锱c模板DNA特異正確的結(jié)合；

　　?、趬A基配對原則；

　　?、跿aq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；

　　?、馨谢虻奶禺愋耘c保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

(2) 靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中小檢出率為3個細(xì)菌。

(3) 熒光定量簡便、快速

PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

(4)對標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。

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PCR檢測步驟:

1、樣品處理

1）按照GB 4789.10-2016（或SN/T 1870-2016），取樣品25g（mL），加入到含有225mL 7.5% NaCl肉湯的無菌容器中均質(zhì)，調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2。

2）36±1℃培養(yǎng)18-24h。

注：也可參考其他地方標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品的前處理。

2、核酸提取

1）取40μL增菌液于裂解液管中，98℃或沸水浴10min。

2）冷卻至室溫，吸取上清備用或者置于-20℃保存。

3、反應(yīng)體系配置

從試劑盒中取出SA預(yù)混液，充分融化，短暫離心，然后將陰性對照、樣品的DNA提取液、陽性對照各取5μL分別加入PCR管中，蓋好管蓋，短暫離心，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

4、PCR擴(kuò)增

PCR管置于PCR儀上，推薦反應(yīng)程序設(shè)定如下：反應(yīng)體系為25μL，在第二步每個循環(huán)60℃時檢測熒光信號，檢測通道選擇FAM。